QuantStudio 5 實時熒光定量PCR系統廣泛應用于基因表達分析、SNP分型、病原檢測等領域。為確保數據準確可靠,操作流程需嚴格執行,涵蓋設備開機、反應體系準備、程序設定、運行監控及后期分析等完整步驟。
在開始實驗前,用戶應進行以下檢查:
電源連接與主機狀態:確認設備電源線連接良好,主機面板無異常指示燈。
樣品倉清潔度:打開樣品艙蓋,確保反應板架與樣品倉無灰塵、無殘液污染。
通風狀態:確保設備四周通風良好,避免過熱影響溫控精度。
軟件環境檢查:確認分析電腦已安裝QuantStudio Design and Analysis軟件,授權完整,版本符合實驗需求。
建議使用正規認證耗材,避免非匹配板、蓋或管導致數據誤差:
96孔熒光定量PCR板(光學透明底)
光學密封膜或專用蓋
微量移液器與濾芯槍頭
冰盒、PCR工作站或潔凈操作平臺
在開始配制之前,應清晰確定以下參數:
目標基因與引物序列
參考基因用于標準化Ct值
樣品組別與生物學重復次數
使用染料:SYBR Green 或 TaqMan 探針
是否需要熔解曲線分析
| 組分 | 體積(μL) |
|---|---|
| 2× Master Mix | 10.0 |
| 上游引物(10 μM) | 0.4 |
| 下游引物(10 μM) | 0.4 |
| 模板DNA/cDNA | 2.0 |
| 無RNA酶水(ddH?O) | 7.2 |
| 總計 | 20.0 |
若使用探針法,應將探針(通常為10 μM)加入反應體系中,同時調整ddH?O體積保持體系總體積恒定。
所有反應組分應在冰上操作,避免酶失活。
操作中盡量減少氣泡產生,氣泡會影響光學讀取信號。
建議配置1–2個無模板對照(NTC)以檢測污染。
將配置好的反應液依序加入96孔板中,對照板架圖進行排布記錄。
蓋上光學密封膜,確保密封緊密,避免蒸發。
輕輕離心(約1000 rpm,30 秒)以除去氣泡并使液體沉于孔底。
打開QuantStudio 5 儀器艙門,將96孔板準確放入樣品托盤。
注意孔板方向,確保A1位置朝前左上角。
關閉艙門,準備軟件設置。
啟動QuantStudio軟件,點擊“新建實驗”。
選擇實驗類型:標準曲線法、相對定量、絕對定量、SNP檢測等。
命名項目并選擇相應反應板類型(96-Well Fast/Standard)。
根據所用染料和探針設定通道:
SYBR Green:常選FAM通道
TaqMan探針:依據熒光標記物選擇(FAM、VIC、HEX等)
| 階段 | 溫度(℃) | 時間 | 循環數 |
|---|---|---|---|
| 初始變性 | 95 | 2分鐘 | 1 |
| 變性 | 95 | 15秒 | 40 |
| 退火/延伸 | 60 | 60秒 | |
| 熔解曲線 | 60–95 | 每步0.3℃ | 1 |
對于不同引物和酶體系,具體溫度和時間應根據優化結果設定。
在軟件中導入樣本信息或手動填寫,包括樣本名稱、組別、目標基因名、參考基因等。
勾選所需孔位對應的檢測通道。
仔細復核實驗設置與孔位標注。
點擊“開始運行”,設備將自動執行程序。
在實驗運行過程中,用戶可通過軟件實時查看以下信息:
熒光增長曲線:評估PCR擴增效率
儀器溫度狀態:監控升降溫準確性
擴增圖譜預覽:識別異常曲線及時終止
一般情況下,整個PCR程序(含熔解曲線)耗時約1小時30分鐘至2小時。
完成擴增后,軟件會生成.qpx實驗文件,可導出為:
.xlsx(Excel)
.pdf(報告格式)
.csv(用于R/Python統計分析)
軟件自動識別參考基因并歸一化Ct值
生成相對表達量柱狀圖或熱圖
可導出標準誤、顯著性分析結果(需設定組別)
評估特異性擴增情況
多峰提示非特異擴增或引物二聚體
無模板對照應無峰
輸入已知拷貝數標準品Ct值,軟件生成標準曲線
R2值用于評估線性相關性
斜率用于推算擴增效率(理想值為–3.3,效率約100%)
實驗結束后,取出96孔板,封存保存(如需保存擴增產物)。
使用無塵布擦拭樣品艙及儀器外殼。
定期清潔樣本托盤與艙蓋內側,避免污染積累。
定期檢查軟件更新,確保使用最新功能模塊。
建議將實驗數據同步至本地磁盤及云端雙重備份。
| 問題 | 原因分析 | 建議解決方案 |
|---|---|---|
| 無擴增曲線 | 引物設計問題或反應體系錯誤 | 檢查引物序列、濃度、模板質量 |
| 熔解曲線多峰 | 引物二聚體或非特異擴增 | 重新設計引物,優化退火溫度 |
| Ct值偏差大 | 加樣誤差或板封不嚴 | 使用多通道移液器并密封嚴密 |
| NTC出現擴增 | 污染或熒光干擾 | 更換試劑,清潔工作區域 |
| 熒光信號過低 | 探針失活或染料降解 | 使用新探針或更換儲存條件 |
QuantStudio 5 實時熒光定量PCR儀不僅在硬件穩定性、光學靈敏度與數據處理能力方面表現優異,其完整的軟件生態和用戶友好界面也極大提升了實驗效率和數據質量。掌握標準化操作流程,是保證qPCR實驗可靠性和可重復性的關鍵。
即便在使用二手設備的情境下,只要嚴格遵守操作流程、做好維護保養,依然可以獲得與新機相近的實驗表現和數據質量。通過本文詳盡步驟指南,希望為各類分子生物學實驗室建立高質量PCR平臺提供有力支持。
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